（一）什么是熒光，簡(jiǎn)單地講，當(dāng)用一定波長(zhǎng)的光（如紫外光）照射某種物質(zhì)時(shí)，經(jīng)過(guò)照射的物質(zhì)在極短時(shí)間內(nèi)即可發(fā)射出一種可見(jiàn)的光，這種光即為熒光。

在生物中，由于產(chǎn)生熒光的方式不同，可以概括地歸納為以下幾種：

1．              自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線照射后能直接發(fā)射出熒光的稱為自發(fā)熒光（或直接熒光）。如植物組織中的葉綠素，經(jīng)紫外線照射后，即可發(fā)出紅色熒光。

2．              次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外線照射后，并不能發(fā)出熒光，但是當(dāng)它吸收熒光染料后也可以產(chǎn)生熒光，這種稱為次生熒光（或間接熒光）。如吖啶橙，DAPI均可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的核酸。

3．              免疫熒光：這種染色法是利用抗原與抗體反應(yīng)的原理，將熒光染料與抗體結(jié)合，然后，將這種標(biāo)記熒光染料的抗體再與相應(yīng)抗原結(jié)合，即形成抗原、抗體復(fù)合物。經(jīng)一定波長(zhǎng)的光激發(fā)后，即可發(fā)射出熒光，以此辨認(rèn)抗原在組織細(xì)胞內(nèi)的分布狀況。這種方法被稱為免疫熒光（或熒光抗體法）。

組織和細(xì)胞中所產(chǎn)生的熒光，須借助熒光顯微鏡方可進(jìn)行觀察，本實(shí)驗(yàn)是用普通顯微鏡配以一種輕便的熒光光源觀察熒光現(xiàn)象。

（二）輕便落射光裝置

落射光裝置的組成：此裝置是為普通顯微鏡配套設(shè)計(jì)的。它是由兩部分組成，一為光源；另一為落射光系統(tǒng)，如圖，落射光系統(tǒng)由激發(fā)濾片組成。當(dāng)光線通過(guò)激發(fā)濾片到達(dá)二向分光鏡時(shí)，使激發(fā)光反射，經(jīng)物鏡后，激發(fā)標(biāo)本，標(biāo)本輻射熒光，又通過(guò)物鏡，分光鏡而到達(dá)目鏡，以供觀察者觀察及記錄。

 

初步了解生物熒光及熒光染色法，學(xué)習(xí)幾種生物熒光標(biāo)本的制作與觀察。

 

（一）生物自發(fā)熒光的觀察

（二）生物的熒光染色法

（三）熒光抗體法

 

（一）生物自發(fā)熒光的觀察

1.       制片

 （1）取一干凈載玻片

 （2）用吸管吸取眼蟲(chóng)培養(yǎng)物，滴于載玻片的中央位置。

 （3）用鑷子取一張蓋玻片，沿液體的邊緣輕輕的蓋上蓋玻片。

 （4）用吸水紙將蓋玻片周邊的多余水吸掉。

2.       觀察

（1）將載玻片置于顯微鏡載物臺(tái)上。

（2）調(diào)節(jié)好光源?？捎^察。注意眼蟲(chóng)的葉綠體呈現(xiàn)何種顏色？

（二）   吖啶橙染色法

吖啶橙是一種經(jīng)常使用的熒光染料，它對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA可同時(shí)染色，但顯示的顏色卻是有差異的。DNA呈綠色熒光，RNA呈桔紅色。

1．  制片

（1）取一干凈載玻片，滴一小滴蛋白膠于載玻片上，涂均勻。稍干。

（2）吸取四膜蟲(chóng)培養(yǎng)液，滴于載玻片中央，待培養(yǎng)液似干未干時(shí)，滴加Carnoy’s液固定蟲(chóng)體5－10分鐘。

（3）將載玻片放入70％酒精中，停留1－2分鐘，然后轉(zhuǎn)入蒸餾水中。

（4）取出載玻片，吸出載玻片上多余水份，轉(zhuǎn)入1％冰醋酸中，停留30秒－1分鐘，再轉(zhuǎn)入蒸餾水。

（5）將載片放入0.1％吖啶橙液（pH4.8～6.0）中，染色1－3分鐘。

（6）將載玻片放入PBS（pH6.0）液中。

（7）將載玻片放入0.1MCaCl中，分化30秒－2分鐘。

（8）轉(zhuǎn)入PBS液中。換3次，每次2－3分鐘。

（9）在標(biāo)本處，滴加PBS－甘油液，輕輕加上蓋玻片。

2．  觀察

（1）       用吸水紙，吸去載玻片上多余的水份。

（2）       將標(biāo)本置于顯微鏡載物臺(tái)上，調(diào)好光源。即可觀察。在顯微鏡下，細(xì)胞中DNA部位呈黃綠色（細(xì)胞核），RNA呈桔紅色（細(xì)胞質(zhì)及核仁）。

（三）   熒光抗體法

熒光抗體染色法，根據(jù)染色步驟的不同，分為兩種。一種為直接染色法，就是將熒光素直接與*抗體結(jié)合，然后，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。另一種為間接染色法，就是將熒光素與第二抗體結(jié)合。此法需進(jìn)行兩次抗原、抗體反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)選用的是間接染色法，反應(yīng)所用一抗為免抗四膜蟲(chóng)抗體。二抗為羊抗兔FITC抗體，具體操作步驟如下：

1．  制片

（1）       固定細(xì)胞

①取一干凈載玻片，畫(huà)定樣品區(qū)域（直徑0.5cm圓圈），加四膜蟲(chóng)，風(fēng)干。

②待涂片似干未干時(shí)，滴加丙酮：乙醇（1：1）液，固定細(xì)胞5～10分鐘。

③將載玻片放入PBS液中，經(jīng)過(guò)3次，每次3－5分鐘。

（2）       *步抗原－抗體反應(yīng)

①將載玻片上多余的水擦干，取10ml二抗滴于標(biāo)本上，放于濕皿內(nèi)，置于37°C，溫育40分鐘。

②取出玻片，經(jīng)PBS液洗3－5次。每次各5分鐘。

（3）       第二步抗原、抗體反應(yīng)

①取10～20ml二抗滴于標(biāo)本上，放于濕皿內(nèi)，置于37°C，溫育40分鐘。

②取出載玻片，經(jīng)PBS液洗3～5次，每次各5分鐘。

（4）       封片

將載玻片上多余的水份擦干，在標(biāo)本處滴一小滴PBS：甘油液，輕輕加上蓋玻片。

2．  觀察

（1）       吸去邊緣多余液體，將載玻片放在顯微鏡載物臺(tái)上。

（2）       調(diào)好光源即可觀察。FITC熒光色素呈黃綠色熒光，觀察你的標(biāo)本中，在細(xì)胞的哪些部位有陽(yáng)性反應(yīng)。

（一）實(shí)驗(yàn)材料：眼蟲(chóng)、四膜蟲(chóng)、兔

（二）試劑：0.1％吖啶橙染色液，PBS（pH6.0）液，1％醋酸，0.1MCaCl₂、蛋白膠、蒸餾水、甘油、PBS（1：9）液，抗體（一抗及二抗），70％酒精，卡氏固定液，乙醇丙酮（1：1）固定液。

（三）器皿：顯微鏡、輕便熒光光源、載玻片、蓋玻片、鑷子、染色缸6個(gè)、培養(yǎng)皿（9.5cm）5個(gè)、培養(yǎng)皿（12.5cm）/個(gè)。